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Exosome miRNA 測序

       外泌體(exosomes)是由細胞內多泡體與細胞膜融合后,釋放到細胞外基質中的一種直徑約 30-120nm 的膜性囊泡。幾乎所有種類的細胞都能分泌外泌體,并存在于人體各種體液之中,包括血液、尿液、唾液、乳汁、腦脊髓液等。外泌體含有細胞特異的蛋白、脂質和核酸,能作為信號分子傳遞給其他細胞從而改變其他細胞的功能,參與免疫反應、抗原遞呈、腫瘤轉移、心腦血管系統、神經系統等生理和病理過程 。


       外泌體可運載不同種類的核酸,如 DNA、mRNA 和 miRNA,rRNA,snoRNA 等,其中 miRNA 受到最多的關注,由于它在基因表達調控上有著重要作用。miRNA 是一類 17-24nt 長的小的非編碼 RNAs,是一類重要的 sRNA(small RNA,sRNA)。miRNA 通過與 mRNA 的 3’ UTR 或者開放閱讀框 ORF 區域結合,能介導基因的轉錄后沉默,與細胞增殖分化、遷移、疾病發生和疾病進展都有關系。外泌體的脂質雙層膜結構,能很好的保護其包被的 miRNA,使其可作為疾病診斷和預后的生物標志物[2],影響腫瘤生長、增殖和轉移。


       外泌體smallRNA 測序可以得到不同組織、不同發育階段、不同疾病狀態下 sRNA 的表達情況,其中 miRNA、siRNA 以及 piRNA 是研究的熱點,也是項目分析的重點。外泌體smallRNA 測序可以找到不同樣本間差異表達的miRNA,也可以鑒定新的miRNA。通過生信分析得到其靶位點所在基因的 GO 功能注釋以及KEGG pathway 注釋,最終可以得到外泌體 small RNA 在生物體中參與的生命活動的一個清晰的生物信息圖譜。


實驗方案
       測序策略:Illumina平臺  SE50

       數據量:10M clean reads/樣


技術優勢
       通量高:一次測序得到上千萬條序列;
       分辨率高:可以檢測小RNA單個堿基的差異;
       精準度高:從幾個到幾十萬個拷貝精確計數;
       可重復性好:深度測序保證了抽樣隨機性,重復性好,無需重復實驗;

       檢測范圍廣:既能鑒定已知小RNA,又能發現新的小RNA。


數據分析
       標準信息分析
(1)按標準流程進行數據整理及數據質量評估;
(2)樣品間的公共序列和特異序列分析;
(3)小RNA與參考基因組比對分析;
(4)按照優先級將小RNA進行分類注釋
(5)Novel Small RNA預測;
(6)樣本間miRNA差異表達分析;
(7)已知miRNA的家族分析;
(8)已知miRNA差異分析(≥2個樣本)和聚類分析(≥3個樣本);
(9)已知miRNA和novel miRNA的靶基因預測;
(10)已知miRNA和novel miRNA的靶基因GO注釋和KEGG通路分析;
(11)novel miRNA差異分析(≥2個樣本)和聚類分析(≥3個樣本);
(12)差異miRNA靶基因預測;

(13)已知miRNA的堿基編輯分析;


       高級信息分析
(1)snoRNA注釋;
(2)piRNA注釋;

(3)mir2disease注釋.


技術流程




案例分析
       案例(1)卵巢癌細胞通過基質細胞外泌體傳遞的miR21靶向APAF1獲得紫杉醇抗性

       晚期卵巢癌細胞通常會發生大網膜脂肪組織處的轉移,但是網膜基質細胞來源的分子對卵巢癌生長的影響還未見太多報道。本文通過二代測序技術發現腫瘤相關的脂肪細胞和成纖維細胞中miR21的表達量明顯高于卵巢癌細胞。通過功能研究發現,腫瘤相關的脂肪細胞和成纖維細胞的miR21可以轉移到卵巢癌細胞中,從而抑制卵巢癌細胞凋亡并通過結合一個新發現的靶mRNA—APAF1賦予其化療抗性。這些數據表明,轉移性卵巢癌細胞的惡性表型可通過從相鄰網膜基質細胞來源的外泌體遞送miR21來獲得,抑制基質細胞來源的miR21可能是治療轉移性或復發性卵巢癌的一個新策略。



圖1 腫瘤相關的脂肪細胞分泌的外泌體中miR21表達上調


圖2 卵巢腫瘤組織和腫瘤細胞系中miR21的表達差異情況


       案例(2)外泌體miRNA可用于非小細胞肺癌的早期診斷
       該研究從早期非小細胞肺癌(NSCLC)患者的血漿中分離腫瘤來源的外泌體。利用miRNA-seq對46個I期NSCLC患者和42個健康個體的外泌體miRNA進行分析,以鑒定和驗證腺癌(AC)和鱗狀細胞癌(SCC)的特異性miRNA。與健康個體相比,AC和SCC患者分別有11個和6個miRNA表達水平顯著增高,13個和8個miRNA表達水平顯著降低。不同的腺癌和鱗癌特異性的外泌體miRNA進一步被驗證。與以前研究報道一致,miRNA-seq數據證實了可用于診斷NSCLC和其他癌癥的潛在miRNA,如let-7、miR-21、miR-24和miR-486。結果表明,miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p為AC特異性的,miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b為SCC特異性的。采用AUC值為0.899、0.936和0.911,分別檢測NSCLC、AC和SCC,評估三種組合miRNA組的診斷準確度。這些miRNA在用于早期NSCLC診斷并用于高度敏感的非侵入性生物標志物是非常有希望的。


圖1 鑒定和定量健康個體、AC患者和SCC患者腫瘤來源的外泌體



圖2 qPCR驗證miRNA表達的結果

       案例(3)外泌體攜帶的miR-25-3p和miR-92a-3p能夠刺激惡性脂肪肉瘤的發
       盡管近年來已發展出針對脂肪肉瘤(LPS)的聯合治療方案,但大部分患者對這些療法僅有輕微應答,并且可能導致局部或遠端的腫瘤復發。早期檢測到腫瘤的復發或轉移可以通過早期臨床干預來改善患者的預后。然而,目前還缺乏有效的生物標志物。該研究使用患者血漿和細胞系作為研究對象,證明了miR-25-3p和miR-92a-3p是由LPS細胞通過細胞外囊泡分泌的,可用作潛在的疾病診斷生物標志物。miR-25-3p和miR-92a-3p以TLR7 / 8依賴性方式刺激腫瘤相關巨噬細胞(TAM)分泌促炎細胞因子IL-6,這反過來促進LPS細胞增殖,侵襲與轉移。該研究提供了新的LPS發展機制,LPS細胞與其微環境之間的通訊對LPS的發展具有重要作用。該研究揭示了循環miRNA可作為疾病診斷以及監測治療效果的生物標志物。


LPS患者樣本中PBV和PB的miRNA表達情況


參考文獻

[1] Au Yeung et al. Exosomal transfer of stroma-derived miR21 confers paclitaxel resistance in ovarian cancer cells through targeting APAF1. Nature Communications, 2016.
[2] Jin et al. Evaluation of tumor-derived exosomal miRNA as potential diagnostic biomarkers for early stage non-small-cell lung cancer using next-generation sequencing. Clinical Cancer Research, 2017.
[3] Casadei et al. Exosome-derived miR-25-3p and miR-92a-3p stimulate liposarcoma progression.Cancer Research, 2017.