16S rDNA測序是細菌基因組中編碼核糖體16S rRNA分子所對應的DNA序列，序列全長約1540bp，由10個保守區和9個可變區（V1-V9）組成。保守區序列在細菌間差異不大而高變區則具有種屬特異性，因此最常用作細菌分類標準。通過提取環境樣品DNA，擴增其中16S rDNA基因（常見擴增區域：V×4區、V3-V4區、V4-V5區），對片段進行高通量測序并與細菌注釋數據庫比對，從而完成對樣品細菌種類、豐度、差異菌群和系統進化等諸多信息分析。這對于研究微生物菌群和疾病之間的發病機制等方面發揮著重要的作用。
應用方向
1. 健康和疾病人群細菌分類鑒定、屬菌豐度統計、差異菌群Biomarker 篩選
2. 疾病與微生物菌群之間發病機制的研究；
實驗方案
測序策略: Illumina NovaSeq 6000，PE250
數據量:每個樣>5萬條raw reads
技術優勢
1. 與微生物傳統鑒定方法相比，16S rDNA測序可以鑒定出許多不能純化培養的新菌種，方法簡便快捷、精確度高、重復性更好；
2. 測序數據量少，具有較低的成本，性價比較高；
3. 可以針對一個或多個可變區進行序列讀取，能更準確的進行細菌分類鑒定；
4. 可以鑒定出低豐度細菌，靈敏度更高；
技術流程
圖1 16S rDNA測序實驗流程
數據分析
(1)按標準流程進行數據整理及數據質量評估;
(2) Tags拼接、過濾;
(3)物種組成分析(與RDP,Silva,GreenGene等數據庫比對) ;
(4) OTU統計及venn圖分析;
(5) OTU Rank曲線;
(6)物種積累曲線;
(7)物種注釋及其豐度分析(柱狀圖和熱圖分析)
(8)物種系統進化分析;
(9)單個樣本復雜度分析(α多樣性分析);
(10)樣本間/組間α多樣性差異統計分析及盒形圖;
(11)樣品間復雜度分析: β多樣性heatmap分析;
(12) β多樣性PCoA分析(2D/3D);
(13) NMDS-2D/3D分析；
(14)樣本組間差異分析: Adonis分析,相似性分析,RDA/CCA分析等;
(15)不同樣本間物種組成聚類分析(樣品數>=3)
(16)其他高級分析:比如PICRUSt預測宏基因組的功能組成。
送樣建議
樣本來源：人、大鼠和小鼠（其它樣本類型請咨詢）
糞便樣本>2g/樣
腸道內容物>100μL/樣
運輸條件：干冰運送
結果展示
圖2 Control-vs-Teatment OTU Venn圖
（在在97%的相似度下，得到了每個樣品的OTU數，利用Venn圖可以展示多樣品共有和各自特有OTU數目，直觀展示樣品間OTU的重疊情況。結合OTU所代表的物種，可以找出不同環境中的核心微生物。圖中不同顏色圖形代表不同樣品或者不同組別，不同顏色圖形之間交疊部分數字為兩個樣品或兩個組別之間共有的OTU個數。）
圖3 樣本Phylum 水平物種豐度組成
圖4 組間Phylum 水平物種豐度組成
圖5 樣本Phylum水平物種豐度熱圖
圖6 組間Phylum水平物種豐度熱圖
圖7 組間Alpha多樣性盒形圖
（組間Alpha多樣性盒形圖，更直觀顯示組間Alpha多樣性差異。盒形圖可以顯示5個統計量（最小值，第一個四分位數，中位數，第三個中位數和最大值，及由下到上的5條線），異常值以“o”標。）
圖8 基于LDAscore篩選的biomarker
圖9 特征物種的柱狀環形圖
案例分析 ：利用16S rDNA 測序對復發性膽總管結石進行微生物群分析
Microbiota analysis with next-generation 16S rDNA gene sequencing in recurrent common bile duct stones[1].
研究方案：內鏡下逆行胰膽管造影術（ERCP）是膽結石的主要治療方法，但術后復發率很高。最近研究表明膽道微生物群參與膽石癥的發病機制。然而膽道微生物群失調與復發性膽石癥相關性機制尚未得到研究；本課題通過收集5例復發性（CBD）結石（FF）患者和45例原發性CBD結石（YF）患者的膽汁標本進行16S rDNA 測序。
研究結果：在門水平上，變形菌門（proteobacteria）和厚壁菌門（firmicutes）是主要的菌屬，FF患者的變形菌門（proteobacteria）含量比較高。此外，FF患者的擬桿菌（Bacteroidetes）和放線菌（actinobacteria）含量低。YF患者膽汁中的微生物菌群比FF患者膽汁中的分布更均勻。進一步研究發現FF患者膽汁微生物多樣性降低。在屬水平上，克雷伯氏菌（klebsiella）在FF患者中占主導地位，而埃希氏志賀氏菌（Escherichia-shigella）在YF患者中占主導地位。此外，FF患者中的克雷伯氏菌高于YF患者。本研究發現了復發性CBD結石FF患者和YF患者之間的微生物菌群在屬水平上的差異，這為膽道微生物群變化與復發性CBD結石之間的關系提供了新的見解。
圖10. YF和FF患者膽汁中微生物菌群的多樣性分析
參考文獻：Tan W, Chen R, Song J, et al. Microbiota analysis with next-generation 16S rDNA gene sequencing in recurrent common bile duct stones[J]. Annals of Translational Medicine, 2022, 10(10).
